TEKNIK MENDAPATKAN VARIETAS BARU YANG UNGGUL

Pemuliaan tanaman adalah rangkaian kegiatan penelitian dan pengujian atau kegiatan penemuan dan pengembangan suatu varietas, sesuai dengan metode baku untuk menghasilkan varietas baru dan mempertahankan kemurnian benih varietas yang dihasilkan. (Undang-undang Republik Indonesia nomor 29 tahun 2000 tentang perlindungan varietas tanaman).

Varietas baru adalah rincian karakteristik tanaman dari varietas yang dimohonkan hak PVT yang meliputi sifat-sifat Kebaruan, Keunikan, Keseragaman dan Kestabilan. Untuk mendapatkan varietas baru dapat menggunakan beberapa metode/teknologi, seperti di bawah ini:

1. Marka Molekuler

            Marka Molekuler adalah upaya membedakan karateristik tanaman pada tingkat gen. Penggunaan marka molekuler utamanya untuk memonitor variasi susunan DNA di dalam dan pada sejumlah spesies serta merekayasa sumber baru variasi genetic dengan mengintroduksi karakter-katakter baik yang baru dari landraces dan spesies-spesies liar.

            Teknologi pembeda pada tingkat genetika menjadi penting terkait dengan perlindungan hak kekayaan intelektual. Para pemulia bisa melindungi varietas temuannya tidak hanya teridentifikasi secara anatomi namun juga secara genetika.  Sehingga sebuah tanaman yang agak berbeda secara fisik tidak dapat diklaim pihak lain sebagai hasil pemuliaanya, jika nyatanya memiliki kesamaan genetic dari bahan tanam milik seorang. 

Di Indonesia sendiri terdapat beberapa metoda melakukan marka molekuler. Antara lain RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), mikrosatelit, SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) dan AFCD (Amplified Fragment Length Polymorphism). 

Langkah awal pelaksanaan marka molekuler adalah mengambil bagian tanaman, biasanya berasal dari daun muda. Kemudian diisolasi DNA-nya, kemudian dicari mana bagian yang bertanggung jawab terhadap karakter unggul pada tanaman.  Biasanya DNA yang diisolasi kemudian akan dihubungkan dengan bank data genetika, untuk mengidentifikasi gen dan menduga karakter yang diekspresikan. 

Melalui marka molekuler maka kepemilikan varietas akan diperkuat dengan identitas tanamannya secara spesifik dalam bentuk gambar atau karakter gen. Dan informasi tersebut menjadi data pendukung deskripsi fisik yang diperloleh dari hasil observasi langsung di lapangan.

Manfaat marka molekuler untuk tujuan pemuliaan tanaman, misalnya:

·         untuk melihat kekerabatan tanaman dan sidik jari, sehingga dapat ditelusuri asal-usul tanaman dan pelabelan tanaman secara molekuler

·         untuk pemetaan genetic, sehingga dapat diketahui porsi gen secara tepat di dalam genom tanaman

·         membantu seleksi tanaman hasil persilangan. Seleksi dengan marka molekuler dapat membantu mempersingkat waktu mendapatkan galur-galur harapan.

2. Nuklir

Teknologi nuklir merupakan salah satu teknologi moderen yang berkembang pesat dalam bidang pertanian.Pemanfaatan teknik nuklir pada tanaman dapat digunakan untuk perbaikan varietas melalui mutasi dengan radiasi.

Di Indonesia, kegiatan penelitian aplikasi teknik nuklir dalam bidang pertanian khususnya untuk pemuliaan tanaman telah dilakukan Badan Tenaga Nuklir Nasional.Tujuan pengembangan penelitian teknik nuklir untuk pemuliaan tanaman adalah untuk memberi kontribusi kepada pemerintah dalam upaya meningkatkan ketahanan pangan nasional. Meski nuklir merupakan teknologi berbahaya bagi manusia, tapi punya efek positif bila dapat memanfaatkan sifat-sifat hakiki dari tenaga ini untuk maksud damai.Banyak orang belum mengetahui, bahwa dengan memanfaatkan sifat-sifat inti atom yang tidak stabil, teknologi nuklirdapat digunakan dalam bidang pertanian, peternakan, pengawetan makanan, hidrologi, industri, dan kedokteran. Padaakhirnya, pemanfaatan teknologi nuklir akan dapat meningkatkan mutu kehidupan dan kesejahteraan masyarakat, Itamenegaskan. Aplikasi teknik nuklir dalam pemuliaan mutasi bisa digunakan untuk memperbaiki satu atau dua sifat yang kurang menguntungkan pada tanaman. Program pemuliaan mutasi di Pusat Aplikasi Teknologi Isotop dan RadiasiBATAN lebih diarahkan pada tanaman pangan, hortikultu ra, dan industri. Dari hasil program pemuliaan mutasi tanamantelah dilepas secara nasional beberapa varietas unggul, antara lain 15 varietas kedelai, satu varietas kacang hijau dansatu varietas kapas. Selain itu, banyak galur mutan harapan dari beberapa jenis tanaman yang masih dalam prosesuntuk dikembangkan menjadi varietas antara lain, padi, kedelai, kacang hijau, ka cang tanah, sorgum, gandum, bawang,artemisia atau tanaman obat, kapas, jarak pagar, dan tanaman hias.

Tujuan pengembangan penelitian teknik nuklir untuk pemuliaan tanaman adalah untuk memberi kontribusi kepada pemerintah dalam upaya meningkatkan ketahanan pangan nasional Program pemuliaan mutasi di Pusat Aplikasi Teknologi Isotop dan Radiasi BATAN lebih diarahkan pada tanaman pangan, hortikultura, dan industri. Teknologi nuklir digunakan untuk pemuliaan tanaman menggunakan teknik mutasi (mutation breeding). Teknik ini nantinya akan dihasilkan keragaman genetik tanaman, yang kemudian melalui proses seleksi dan pengujian lebih lanjut, akan diperoleh suatu varietas unggul tanaman. Mutasi adalah perubahan pada materi genetik suatu makhluk yang terjadi secara tiba-tiba, acak, dan merupakan dasar bagi sumber variasi organisme hidup yang bersifat terwariskan (heritable). Mutasi sendiri ada yang bersifat spontan di alam (spontaneous mutations) ataupun secara induksi (induced mutation). Keduanya sama-sama menghasilkan variasi genetik sebagai dasar seleksi tanaman yang akan diteliti. Oleh sebab itu ada yang mengatakan bahwa pemuliaan tanaman menggunakan metode rekayasa genetic.

Mutasi induksi dapat dilakukan pada tanaman dengan perlakuan bahan mutagen tertentu terhadap organ reproduksi tanaman seperti biji, stek batang, serbuk sari, akar rhizome, kultur jaringan dan sebagainya. Jika mutasi di alam terjadi secara lambat, spektrum, percepatan dan frekuansi mutasi dari tanaman dapat dinaikkan dengan perlakuan penambahan mutagen. Contoh mutagen yang sering digunakan adalah diethyl sulphate (dES), methyl methane sulphonate (MMS), hydroxylamine yang termasuk kelompok mutagen kimia; sinar-X, radiasi Gamma, radiasi beta, neutrons yang termasuk mutagen fisika.

Varietas unggul yang telah diproduksi BATAN meliputi tanaman padi jenis Atomita-1, Atomita-2, Atomita-3, Atomita-4, Cilosari, Situgintung, Mira-1, Diah Suci, dll; kacang hijau jenis Camar; kedelai jenis Muria, Rajabasa, Tengger. Realisasi di lapangan, tanaman varietas unggul tersebut disesuaikan dengan kondisi daerah dan keinginan masyarakat setempat seperti Sumatera yang lebih suka beras pera berbeda dengan Jawa Barat yang lebih menggemari beras pulen. Tetapi penggunaan nuklir dalam kehidupan sehari-hari perlu studi kelayakan dan evaluasi juga pertimbangan pembiayaannya, harus dilakukan seefektif mungkin untuk meminimalisasi terjadinya radiasi bahan radio aktif bagi kesehatan masyarakat yang tinggal di lokasi sekitarnya dan para pekerjanya sendiri.

3. Rekombinan DNA

Perkembangan dan kemajuan yang dicapai dalam bidang biologi molekuler telah melahirkan dan berkembangnya teknologi rekombinan DNA atau yang dikenal dengan sebutan rekayasa genetik .  Rekayasa genetik atau rekombinan DNA  adalah suatu kumpulan teknik-teknik eksperimental yang memungkinkan peneliti untuk mengisolasi, mengidentifiksi dan melipatgandaan suatu fragmen dari material genetik (DNA) dalam bentuk murninya.  Manipulasi-manipulasi tersebut dilakukan secara in vitro dengan menggunakan material-material biologi

Penggunaan kultur jaringan untuk pembiakan  klonal didasarkan pada  anggapan bahwa jaringan secara genetik tetap stabil jika dipisahkan dari tumbuhan induk dan ditempatkan dalam kultur.  Pendapat ini sebahagian besar berlaku jika tumbuhan dibiakkan dengan kuncup ketiak atau tunas liar yang secara langsung dipisahkan dari tanaman.  Walaupun demikian, apabila tunas terbentuk dari jaringan kalus, sering terjadi penyimpangan (Chaleff, 1984).

Protoplas sel totipoten tanpa dinding sel dapat dihasilkan dengan mudah dan telah dirancang  suatu metode untuk menumbuhkannya menjadi jaringan kalus dan dilanjutkan menjadi tanaman kecil yang dapat dikembangbiakan secara konvensional.  Protoplas dapat dipisahkan dari jaringan tanaman, termasuk akar, daun, buah, serbuk sari, bintil akar kacangan, organ penyimpanan dan jaringan kalus.  Jaringan daun sering digunakan karena hasil protoplas dari sumber ini cukup tinggi dan seragam.  Protoplas sering menghasilkan jaringan kalus yang kemudian dari kalus ini diregenerasikan suatu  tumbuhan yang lengkap.  Sayangnya, keberhasilan metoda ini kecil peluangnya  untuk tanaman kacang-kacangan dan padi-padian.  Belakangan ini kemungkinan tanaman Medicago sativa (Alfafa)  untuk beregenerasi dari protoplasma menjadi tumbuhan lengkap peluangnya  cukup tinggi dalam kondisi pertumbuhan yang relatif sederhana.  Hal ini memberi petunjuk penting bahwa usaha dibidang kacang-kacangan akan dapat berkembang lebih cepat.   Sebegitu jauh kita masih belum mampu untuk mengembangkan tumbuhan dari jenis padi-padian dan kacang-kacangan melalui pertumbuhan protoplasma.

Manfaat penting dari protoplasma dalam pemuliaaan tanaman terletak pada beberapa sifatnya, yaitu :

(1)   protoplas dapat dihasilkan dan disaring untuk membentuk banyak variasi. Meskipun protoplas yang terbentuk secara genetik bersifat homogen, tetapi kalus yang merupakan keturunannya dapat menjadi tanaman yang menunjukan perbedaan  sifat-sifat yang cukup besar,

(2)   tidak adanya dinding sel memudahkan fusi antara protoplas dan dengan demikian mengawali terjadinya pembastaran. Fakta bahwa fusi dapat terjadi antara sel somatik yang bersifat diploid yang memungkinkan   pemulia tanaman merancang suatu teknik dengan baik

(3)   tidak adanya dinding sel juga memudahkan penyerapan DNA, sebagai fragmen atau plasmid yang berasal dari bakteri, untuk menghasilkan tanaman dengan sifat-sifat yang baru sama sekali.

Meskipun tanaman yang diperbanyak secara vegetatif (klon) umumnya mirip induknya, tetapi tidak berarti, bahwa semua klon secara genetik bersifat serupa. Klon yang berbeda secara nyata dari induknya dapat terjadi, dan dikenal sebagai varian somatik dan merupakan hasil perubahan genetik pada sel merismatik yang menghasilkan semua atau sebagian tumbuhan baru. Dalam hal-hal tertentu varian somatik  dapat menjadi varietas baru yang penting, misalnya pada jeruk manis. Beberapa mekanisme genetik dapat menyebabkan terjadinya variasi somatik, antara lain : perubahan jumlah kromosom dalam inti, mutasi gen tunggal, seperti kloroplas dan mitokondria.

Meskipun fusi protoplas tumbuhan diketahui jarang terjadi, namun Power  dan kawan-kawan tahun 1970,  berhasil merancang suatu metode untuk mengendalikan fusi yang dapat diulang, dan dengan demikian menemukan langkah awal untuk pembastaran somatik pada tumbuhan. Suspensi protoplas dalam 0,25 mol/l larutan natrium nitrat dapat  menginduksi   fusi yang cepat.   Larutan 10,2% sukrosa,  5,5% natrium nitrat dan kalsium klorida dapat digunakan untuk menginduksi  fusi protoplas Parthenocissus tricuspidata dengan protoplas Petunia hibrida.

Tahap berikutnya adalah membangkitkan bastar somatik dengan teknik fusi protoplasma yaitu dengan : isolasi protoplasma, fusi, pembentukan kembali dinding sel, fusi inti untuk mendapatkan inti bastar sejati, pertumbuhan sel bastar dalam kultur, dan akhirnya pembentukan tumbuhan secara lengkap.

Pada umumnya, fusi kloroplas tumbuhan mudah dicapai, meskipun tidak mudah untuk menumbuhkan sel bastar dengan memuaskan.  Dari hal ini jelaslah bahwa protoplas bastar yang hanya sedikit terdapat dalam campuran sel perlu dipisahkan  dan mendorong perkembangannya melalui prosedur seleksi.  Sebagai contoh  pembastaran somatik antara Petunia hybrida dengan Petunia parodii, yang prosedur seleksinya memanfaatkan adanya perbedaan kekuatan potensi pertumbuhan antara  protoplas daun kedua jenis tumbuhan ini.  Protoplas Petunia parodiipaling tinggi hanya dapat membentuk kalus kecil yang terdiri dari lebih kurang lima puluh sel pada media, sedangkan protoplas Petunia hybrida terus menerus membentuk kalus.  Sebaliknya dari kepekaannya  terhadap aktinomisin D, Petunia hybrida lebih peka terhadap aktinomisin D dari protoplas Petunia parodi .

Inti campuran (heterokarion) yang terjadi pada fusi dua protoplas yang tidak sama dapat berkembang menjadi sel  bastar dengan fusi inti.  Dengan cara ini semua organel dari kedua protoplas pembawa gen yang dapat mengadakan seleksi   sendiri, digabung, sedangkan pada persilangan seksual biasa, satu inti yang membawa gen kromosomal (karyom) yang berasal dari masing-masing induk, tetapi bisanya gen yang diwariskan melalui plastida (plastidom)  dan gen yang diwariskan melalui mitokondria (kondriom) hanya berasal dari induk betina.  Dengan demikian, teknik fusi protoplasma memberikan kesempatan untuk menghasilkan kombinasi dua genom induk yang lengkap.

Salah satu keuntungan utama yang diberikan oleh kultur untuk percobaan genetik dengan tumbuhan lebih tinggi adalah bahwa kultur sel itu memungkinkan seleksi langsung untuk memperoleh fenotipe baru dari sejumlah besar populasi sel yang ditumbuhkan pada kondisi tertentu dan dari segi fisiologis dan perkembangan bersifat seragam.  Jutaan sel, masing-masing mempunyai potensi untuk menjadi  tumbuhan dapat dikulturkan dalam satu cawan petri.

Berbagai metoda telah dikembangkan dan digunakan untuk membuat tanaman transgenik, termasuk diantaranya penggunaan plasmid Ti dengan Agrobacterium tumefaciens.   Metoda lain yang juga telah dikembangkan adalah metoda gen transfer menggunakan kloroplas, mikroinjeksi DNA, elektroforasi, penembakkan dengan mikroproyektil (Uchimiya, 1989)

Agrobacterium tumefacien efektif digunakan sebagai sistim transfer gen tanaman dikotil, meskipun tidak semua tanaman dikotil menunjukkan respon yang sama terhadap sistim tranformasi ini.  Kedelai misalnya termasuk spesies tanaman yang sulit direkayasa denganAgrobacterium.  Kekurangan yang mencolok dalam sistim ini adalah kesulitan dengan tanaman monokotil, terutama golongan serelia seperti : padi, jagung, gandum dan lain-lain yang tidak dapat ditransformasi dengan Agrobacterium (Wu, 1990).

Teknik-teknik gen transfer berkembang dengan cepat dan terus disempurnakan.  Dalam beberapa tahun terakhir, gen transfer pada tanaman sudah merupakan kegiatan rutin yang dilakukan di beberapa laboratorium di dunia. metoda yang efisien dalam mengklon gen,  teknik transformasi, regenerasi tanaman, ketersediaan konstruksi-konstruksi gen baru, sistim vektor yang terus dikembangkan, promotor yang spesifik untuk organ tertentu untuk ekspresi gen adalah faktor-faktor yang berperan dalam memproduksi tanaman transgenik.

Pada awalnya, gen yang banyak dipakai dalam transfer tanaman adalah gen-gen reporter yang fungsinya lebih banyak untuk uji pengembangan teknik transfer itu sendiri, atau mempelajari kemampuan sekuens pengendali dalam mengendalikan ekspresi suatu gen di dalam sel tanaman.  Kemudian terus dikembangkan transfer klon gen yang mengendalikan karakter-karakter yang mempunyai nilai ekonomis sejalan dengan tersedianya klon gen tersebut.  Karakter-karakter tersebut diantaranya adalah  gen untuk ketahanan terhadap serangga, gen untuk ketahanan terhadap penyakit virus dan bakteri, gen  ketahanan terhadap herbisida, toleransi terhadap salinitas, kekeringan dan peningkatan kualitas nutrisi.

4. Transfer Gen

Cara ini dikenal pula sebagai transformasi DNA. Gen dari organisme lain disisipkan ke dalam DNA tanaman untuk tujuan tertentu. Strategi pemuliaan ini banyak mendapat penentangan dari kelompok-kelompok lingkungan karena kultivar yang dihasilkan dianggap membahayakan lingkungan jika dibudidayakan.

Transformasi tanaman yang dimediasi dengan Agrobacterium tumefaciens merupakan metode transformasi tanaman yang paling umum digunakan A. tumefaciens secara alami menginfeksi tumbuhan dikotil dan menyebabkan tumor yang disebut ‘crown gall’ Bakteri ini merupakan bakteri gram negatif yang menyebabkan crown gall dengan mentransfer bagian DNA-nya (dikenal sebagai T-DNA) dari Tumour inducing plasmid (Ti plasmid) ke dalam inti sel dan berintegrasi dengan genom sehingga menyebabkan penyakit ‘crown gall’.T-DNA mengandung 2 tipe gen, gen onkogenik yang menyandikan enzim termasuk sintesis auksin dan sitokinin dan membentuk formasi tumor, serta gen yang menyandikan sintesis opin, hasil dari kondensasi asam amino dan gula. Opin dihasilkan dan diekskresikan sel ‘crown gall’ dan digunakan oleh A. tumefaciens sebagai sumber karbon dan nitrogen. Sementara gen untuk reaksi katabolisme opin, gen yang membantu transfer T-DNA dari bakteri ke sel tanaman, dan gen tansfer konjugatif plasmid, terdapat diluar T-DNA.

A. tumefaciens terlebih dahulu melakukan pelekatan pada permukaan sel tanaman dengan membentuk mikrofibril sehingga menyebabkan terjadinya luka pada tanaman yang akan mengeluarkan senyawa fenolik yaitu asetosiringone sebagai respon sinyal. Sinyal tersebut mengaktifkan virA yang merupakan protein kinase untuk mengaktifkan virG dan memfosforilasinya menjadi virG-P. Dengan aktifnya virG-P ini akan mengaktifkan gen-gen vir lainnya untuk mulai bersifat virulen dan melakukan transfer VirD untuk memotong situs spesifik pada Ti plasmid, pada sisi kiri dan kanannya sehingga melepaskan T-DNA yang akan ditransfer dari bakteri ke sel tanaman . T-DNA utas tunggal akan diikat oleh protein VirE yang merupakan single strand binding protein sehingga terlindung dari degradasi. Bersamaan dengan itu, protein virB membentuk saluran transmembran ysng menghubungkan sel A. tumefaciens dan sel tanaman sehingga T-DNA dapat masuk ke sel tanaman. Gen pada T-DNA, yang meliputi gen auksin, sitokinin dan opin, ikut terekspresi sehingga memacu pertumbuhan sel tanaman menjadi banyak (tumor.

Dengan adanya teknologi transformasi yang dimediasi A. tumefaciens ini berperan dalam menghasilkan tanaman transgenik, seperti tanaman tembakau yang tahan terhadap antibiotik tertentu. Resistensi terhadap antibiotik ini didapatkan dari bakteri yang turut menyisip pada T-DNA A. tumefaciens.

5. Mutasi Radiasi

Pemuliaan tanaman dengan teknik mutasi radiasi untuk mendapatkan varietas baru dilakukan dengan cara mengiradiasi biji tanaman yang dikehendaki pada dosis tertentu. Radiasi yang digunakan adalah sinar gamma yang mampu menembus biji tanaman hingga pada lapisan DNA (gen pembawa sifat keturunan). Perubahan yang terjadi pada DNA akan menghasilkan perubahan sifat pada keturunannya. Perubahan sifat secara genetik dapat diamati melalui pertumbuhan tanaman. Dengan teknik ini dapat diperoleh sifat-sifat baru yang lebih unggul dari varietas induknya, meliputi daya hasil, daya adaptasi, umur tanaman, serta ketahanan terhadap hama dan penyakit. Penyinaran radiasi terhadap biji tanaman tidak mengakibatkan biji menjadi bersifat radioaktif.

Arti dari mutasi dalam bahasan ini adalah suatu proses dimana suatu gen mengalami perubahan struktur dan/atau suatu perubahan sifat keturunan yang mengakibatkan perubahan fenotipe yang diwariskan dari satu generasi ke generasi selanjutnya. Sedangkan radiasi adalah pancaran energi melalui materi atau ruang dalam bentuk partikel atau gelombang elektromagnetik / cahaya (foton) dari sumber radiasi.

Keuntungan pemuliaan tanaman dengan teknik mutasi radiasi adalah prosesnya yang relatif cepat dibanding teknik lain, dapat memperbaiki satu atau dua sifat tanaman, dapat menimbulkan sifat baru, serta dapat mematahkan dua sifat yang linkage.

Teknik mutasi radiasi telah dilakukan di BATAN sejak tahun 1980-an. Sebagai contoh adalah seleksi pedigree varietas padi Cisantana dengan penyinaran radiasi sinar gamma dosis 0,2 kGy menggunakan irradiator gamma (gambar 2.) menghasilkan varietas baru yang diberi nama Bestari. Perbaikan yang dihasilkan adalah dihilangkannya bulu pada gabah Cisantana (gambar 3.). Adanya bulu tidak disukai petani karena dapat menurunkan rendemen beras. Selain itu, potensi hasil produksi juga meningkat dibandingkan dengan varietas induknya, yaitu dari 7,0 ton/ha menjadi 9,42 ton/ha. Kadar amilosanya turun dari 23 % menjadi 20,62 %. Kadar amilosa menentukan tekstur nasi, nilai kadar amilosa antara 10 – 20 % tekstur nasinya sangat pulen, antara 20 – 25 % pulen dan diatas 25 % merupakan nasi pera.

6. Kultur jaringan

Merupakan salah satu cara perbanyakan tanaman secara vegetatif. Kultur jaringan merupakan teknik perbanyakan tanaman dengan cara mengisolasi bagian tanaman seperti daun, mata tunas, serta menumbuhkan bagian-bagian tersebut dalam media buatan secara aseptik yang kaya nutrisi dan zat pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus cahaya sehingga bagian tanaman dapat memperbanyak diri dan bergenerasi menjadi tanaman lengkap. Prinsip utama dari teknik kultur jaringan adalah perbayakan tanaman dengan menggunakan bagian vegetatif tanaman menggunakan media buatan yang dilakukan di tempat steril. 

Metode kultur jaringan dikembangkan untuk membantu memperbanyak tanaman, khususnya untuk tanaman yang sulit dikembangbiakkan secara generatif. Bibit yang dihasilkan dari kultur jaringan mempunyai beberapa keunggulan, antara lain: mempunyai sifat yang identik dengan induknya, dapat diperbanyak dalam jumlah yang besar sehingga  tidak terlalu membutuhkan tempat yang luas, mampu menghasilkan bibit dengan jumlah besar dalam waktu yang singkat, kesehatan dan mutu bibit lebih terjamin, kecepatan tumbuh bibit lebih cepat dibandingkan dengan perbanyakan konvensional. 

Tahapan yang dilakukan dalam perbanyakan tanaman dengan teknik kultur jaringan adalah:
1)    Pembuatan media
2)    Inisiasi
3)    Sterilisasi
4)    Multiplikasi
5)    Pengakaran
6)    Aklimatisasi

Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur jaringan.  Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam mineral, vitamin, dan hormon.  Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan seperti agar, gula, dan lain-lain.  Zat pengatur tumbuh (hormon) yang ditambahkan juga bervariasi, baik jenisnya maupun jumlahnya, tergantung dengan tujuan dari kultur jaringan yang dilakukan.  Media yang sudah jadi ditempatkan pada tabung reaksi atau botol-botol kaca.  Media yang digunakan juga harus disterilkan dengan cara memanaskannya dengan autoklaf.

Inisiasi adalah pengambilan eksplan dari bagian tanaman yang akan dikulturkan. Bagian tanaman yang sering digunakan untuk kegiatan kultur jaringan adalah tunas. 

Sterilisasi adalah bahwa segala kegiatan dalam kultur jaringan harus dilakukan di tempat yang steril, yaitu di laminar flow dan menggunakan alat-alat yang juga steril. Sterilisasi juga dilakukan terhadap peralatan, yaitu menggunakan etanol yang disemprotkan secara merata pada peralatan yang digunakan.  Teknisi yang melakukan kultur jaringan juga harus steril.  

Multiplikasi adalah kegiatan memperbanyak calon tanaman dengan menanam eksplan pada media. Kegiatan ini dilakukan di laminar flow untuk menghindari adanya kontaminasi yang menyebabkan gagalnya pertumbuhan eksplan.  Tabung reaksi yang telah ditanami ekplan diletakkan pada rak-rak dan ditempatkan di tempat yang steril dengan suhu kamar.

Pengakaran adalah fase dimana eksplan akan menunjukkan adanya pertumbuhan akar yang menandai bahwa proses kultur jaringan yang dilakukan mulai berjalan dengan baik.  Pengamatan dilakukan setiap hari untuk melihat pertumbuhan dan perkembangan akar serta untuk melihat adanya kontaminasi oleh bakteri ataupun jamur. Eksplan yang terkontaminasi akan menunjukkan gejala seperti berwarna putih atau biru (disebabkan jamur) atau busuk (disebabkan bakteri). 

Aklimatisasi adalah kegiatan memindahkan eksplan keluar dari ruangan aseptic ke bedeng. Pemindahan dilakukan secara hati-hati dan bertahap, yaitu dengan memberikan sungkup. Sungkup digunakan untuk melindungi bibit dari udara luar dan serangan hama penyakit karena bibit hasil kultur jaringan sangat rentan terhadap serangan hama penyakit dan udara luar. Setelah bibit mampu beradaptasi dengan lingkungan barunya maka secara bertahap sungkup dilepaskan dan pemeliharaan bibit dilakukan dengan cara yang sama dengan pemeliharaan bibit generatif. 

Keunggulan inilah yang menarik bagi produsen bibit untuk mulai mengembangkan usaha kultur jaringan ini. Saat ini sudah terdapat beberapa tanaman kehutanan yang dikembangbiakkan dengan teknik kultur jaringan, antara lain adalah: jati, sengon, akasia, dll.

Bibit hasil kultur jaringan yang ditanam di beberapa areal menunjukkan pertumbuhan yang baik, bahkan jati hasil kultur jaringan yang sering disebut dengan jati emas dapat dipanen dalam jangka waktu yang relatif lebih pendek dibandingkan dengan tanaman jati yang berasal dari benih generatif, terlepas dari kualitas kayunya yang belum teruji di Indonesia. Hal ini sangat menguntungkan pengusaha karena akan memperoleh hasil yang lebih cepat. Selain itu, dengan adanya pertumbuhan tanaman yang lebih cepat maka lahan-lahan yang kosong dapat c

KEUNTUNGAN PEMANFAATAN KULTUR JARINGAN

� Pengadaan bibit tidak tergantung musim

� Bibit dapat diproduksi dalam jumlah banyak dengan waktu yang relatif lebih cepat (dari satu mata tunas yang sudah respon dalam 1 tahun dapat dihasilkan minimal 10.000 planlet/bibit)

� Bibit yang dihasilkan seragam

� Bibit yang dihasilkan bebas penyakit (meng gunakan organ tertentu)

� Biaya pengangkutan bibit relatif lebih murah dan mudah

� Dalam proses pembibitan bebas dari gang guan hama, penyakit, dan deraan lingkungan lainnya

KULTUR jaringan adalah serangkaian kegiatan yang dilakukan untuk membuat bagian tanaman (akar, tunas, jaringan tumbuh tanaman) tumbuh menjadi tanaman utuh (sempurna) dikondisi invitro (didalam gelas).
Keuntungan dari kultur jaringan lebih hemat tempat, hemat waktu, dan tanaman yang diperbanyak dengan kultur jaringan mempunyai sifat sama
atau seragam dengan induknya. Contoh tanaman yang sudah lazim diperbanyak secara kultur jaringan adalah tanaman anggrek.